cfDNA在樣品中的含量本身有一定的差異；對(duì)于樣品本身，要注意其來(lái)源和儲(chǔ)存條件，血漿、血清分離的時(shí)間避免過(guò)長(zhǎng)，凍存后注意避免溫度波動(dòng)及反復(fù)凍融；在試劑盒使用過(guò)程中，建議操作人員盡量避免更換以減少操作誤差導(dǎo)致的得率波動(dòng)

血清、血漿均可；樣品起始量根據(jù)不同產(chǎn)品在0.2-10mL之間；建議起始樣品量不少于2mL

ELISA的測(cè)定結(jié)果可分為兩種：定性測(cè)定和定量測(cè)定。前者只需確定陰性或陽(yáng)性即可；后者則需要給具體的數(shù)值。在定量測(cè)定中，經(jīng)常要將標(biāo)準(zhǔn)品所獲得的吸光值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

讀板時(shí)要保證酶標(biāo)板清潔，同時(shí)也要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。 通常，單波長(zhǎng)讀板的測(cè)定值一般是指以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)讀板的測(cè)定值一般是敏感波長(zhǎng)如450nm的吸光值與非敏感波長(zhǎng)下如630nm的吸光值之差，可排除板內(nèi)臟物的影響。同時(shí)，由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長(zhǎng)比色

目前以HRP作為標(biāo)記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以O(shè)PD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。顯色劑配制后放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（肉眼可見(jiàn)淺藍(lán)色的TMB時(shí)）要棄之不用。在加入底物開始顯色反應(yīng)前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。 顯色反應(yīng)條件一般為37℃或室溫反應(yīng)15-30分鐘。加終止液時(shí)，要避免氣泡產(chǎn)生而引起的假陽(yáng)性

為了確保ELISA測(cè)定的特異性，洗板可清除非特異性結(jié)合物質(zhì)，減少背景信號(hào)，增加分析的信噪比。 手工洗板時(shí)，拍板要垂直，避免交叉污染，用力不能過(guò)猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離。使用半自動(dòng)洗板時(shí)，應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出。為了達(dá)到較好的洗滌效果，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，即在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次。 以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05% Tween20的中性PBS，其中，吐溫20的濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實(shí)驗(yàn)的靈敏度

一般孵育時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，所需時(shí)間相對(duì)較短。最常用的孵育溫度為37℃，孵育1-2h。 孵育時(shí)應(yīng)貼封片或加蓋，避免樣品或稀釋液蒸發(fā)，吸附于孔壁，難于清洗。孵育時(shí)，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。同時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制孵育時(shí)間，避免因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致緊附于反應(yīng)孔周圍的非特異性結(jié)合。 孵育時(shí)，要盡量排除“邊緣效應(yīng)”，即96孔板的外周孔顯色較中心孔深。究其原因，是因?yàn)?6孔板周孔與中心孔的表面或熱力學(xué)特征不同。因此，可采用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至孵育溫度（37℃）

因ELISA的靈敏度較高，則應(yīng)該按規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái)。 加樣品時(shí)，單孔用量要求：≥20ul/指標(biāo)，如需要做2個(gè)復(fù)孔則血量≥60ul/指標(biāo)。如果用量充足，最好提供50ul/孔/指標(biāo)。具體用量也需根據(jù)試劑盒的要求而定。 吸取樣品時(shí)，加樣槍頭不應(yīng)粘附多余的液體；加樣時(shí)不可90度向孔中滴加液體，否則會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。加樣時(shí)速度不可過(guò)快，否則無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性；要避免樣品加在孔壁上部而產(chǎn)生非特異性吸附。不可將樣品濺出以避免對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染